Leber遗传性视神经病变（LHON）是一种典型的母系遗传性视神经萎缩，预计在我国患者多达10万人。该病好发于青少年男性，主要累及视网膜视神经节，表现为双眼同时或先后急性或亚急性视力减退，临床上仅能通过药物进行辅助治疗，视力损伤不可逆，给患者和家庭带来沉重的痛苦和经济负担。LHON患者视网膜神经节细胞（RGC）的退化是其发病的主要原因，至今尚无有效的治疗方法。针对于LHON受mtDNA突变和核修饰因子或表观遗传因素共同作用的特点，基因治疗和基于CRISPR的基因组编辑技术在其精准治疗方面具有广阔的应用前景。

图1.基于腺相关病毒（AAV）与异位表达技术对LHON进行基因治疗

针对mtDNA突变的患者，通过异位表达方式，将野生型ND6 基因序列中的 6 个非通用密码子修改为通用密码子，并对该序列进行优化，使其能细胞核内转录正常ND6基因，经线粒体靶向序列将胞质表达ND6蛋白导入线粒体，最终修复复合体Ⅰ的功能缺陷。体外实验表明，异位表达ND6能提高携带m. 14484 T>C突变细胞的ND6蛋白表达水平，并恢复复合体Ⅰ的酶活性和组装，促进线粒体膜电位和ATP上升，ROS水平显著下降，恢复受损的线粒体自噬过程，减少突变导致的细胞凋亡过程。

图2. 优化线粒体导肽实现线粒体编码蛋白的异位表达

针对核修饰基因突变的患者，我们分离获得一个中国LHON家系中患者特异的皮肤成纤维细胞，并将其重编程为诱导多能干细胞。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对患者源iPSC中YARS2突变进行了基因矫正，再将iPSC定向分化成RGC。同时携带m.11778G>A和YARS2突变的RGC在神经元分化、形态和电生理特性方面表现出比只携带m.11778G>A突变的细胞更严重的缺陷，氧气消耗率、线粒体ATP的水平和活性氧生产的增加等方面降低显著，诱发了RGC退化凋亡。而YARS2基因进行遗传矫正恢复了突变引起的线粒体功能障碍，重塑了患者源RGC的形态和功能。

图3. 干细胞结合基因编辑实现视神经节细胞的功能重塑

综上所述，我们证实人ND6异位表达能恢复m.14484T>C引起的复合体I缺陷、细胞凋亡和线粒体自噬；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的基因矫正使患者衍生的RGC的形态和功能得到恢复。不仅为LHON的治疗提供了颇具前景的治疗方案，也为其他线粒体疾病的干预治疗提供了科学依据和技术支撑。

参考文献

1. Wang J, et al. Optimized allotopic expression of mitochondrial ND6 transgene restored complex I and apoptosis deficiencies caused by LHON-linked ND6 14484T > C mutation. J Biomed Sci. 2023;30(1):63.   

2. Chen C, et al. Induced pluripotent stem cells: ex vivo models for human diseases due to mitochondrial DNA mutations. J Biomed Sci. 2023;30(1):82.

3. Yu J, et al. PRICKLE3 linked to ATPase biogenesis manifested Leber's hereditary optic neuropathy. J Clin Invest. 2020;130(9):4935-4946.

4. Chen JR, et al. Nuclear modifier YARS2 allele correction restored retinal ganglion cells-specific deficiencies in Leber's hereditary optic neuropathy. Hum Mol Genet. 2023;32(9):1539-1551.