2022年9月管敏鑫教授课题组在《核酸研究》上发文揭示线粒体DNA突变影响线粒体DNA复制和tRNA代谢诱发耳聋的新机制

2022年8月30日，浙江大学遗传学研究所管敏鑫教授课题组在国际权威学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表了线粒体DNA突变引发耳聋的最新研究成果（原文链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac720/6678873）。该研究揭示了线粒体DNA突变引发线粒体DNA复制异常、线粒体tRNA结构和功能变化，从而导致听力损伤的致病新机制，是耳聋疾病机制研究的新视角。

耳聋由遗传和环境两方面因素单独或共同引发，约 60%的耳聋患者是由遗传因素造成。耳聋的具体遗传方式包括孟德尔遗传（常染色体显性、隐形，X连锁）与非孟德尔遗传（母系遗传）。母系遗传即遗传性状只能通过母亲传给后代，表现为“女传，男不传”，而负责这一部分遗传信息传递的细胞器就是线粒体。线粒体是细胞的“动力工厂”，为细胞代谢提供 90%的 ATP，在细胞调亡过程中也发挥了关键调节作用。线粒体是半自主细胞器，拥有自身遗传物质——线粒体DNA。线粒体DNA总长16569 bp，为共价闭环的双链分子（重链、轻链），含有两个复制起始位点（重链复制起始位点OriH、轻链复制起始位点OriL），编码37个基因，包括13个氧化磷酸化复合体的多肽亚基，２个rRNA (12S rRNA和16S rRNA) 和 22个tRNA。线粒体基因排列紧凑无内含子，部分基因序列间发生重叠，tRNA基因有规律地嵌布在rRNA基因和多肽编码基因之间，一般认为其在转录产物成熟过程中起到剪切信号的作用。线粒体自身拥有DNA复制、转录及蛋白翻译的整套体系， tRNA在蛋白翻译中扮演“转运工”的角色，rRNA是蛋白翻译“场所”核糖体的重要组成部分。线粒体其他千余种线粒体蛋白包括呼吸链复合体亚基、DNA 复制转录翻译因子等由核基因编码，在细胞质中合成，转运到线粒体内行使功能。由线粒体基因或核基因突变导致的线粒体代谢障碍，常累及能量需求高的组织器官，尤其是听觉器官。线粒体相关基因突变是造成耳聋，尤其是药物性耳聋的重要原因之一。

管敏鑫教授从事母系遗传性耳聋与药物性耳聋的基础研究和临床转化近三十年，从临床家系分析，到实验室研究，再到疾病干预，取得了一系列具有国际领先水平的创新性研究成果。系统性地阐述了线粒体 12S rRNA突变 m.1555A>G和m.1494C>T导致非综合征型耳聋与药物性耳聋的致病机制：1555A>G和1494C>T突变位于线粒体核糖体A位点，这一改变使得线粒体核糖体的结构与细菌核糖体的更加相似，以致氨基糖苷类抗生素更加容易与 12S rRNA 结合, 从而解释了为何携带这些突变的个体在使用了此类抗生素后导致耳聋（一针致聋）；多维度阐明了线粒体tRNA突变在耳聋疾病发生中的作用：m.7511T>C、m.7505T>C和m.12201T>C突变引起tRNA结构折叠/维持及tRNA 氨酰化等功能改变，m.14692A>G、m.7551A>G和m.4295A>G突变导致tRNA碱基修饰缺失，m.7445T>C和m.7516DelA突变引发tRNA 前体剪切加工障碍，这些线粒体 tRNA 代谢障碍引发蛋白质合成缺陷，进而造成线粒体功能异常，最终导致耳聋；发现了调控线粒体12S rRNA基因突变耳聋表型表达的核修饰基因TRMU、MTO1、GTPBP3，开创性地提出了核修饰基因和线粒体基因相互作用导致耳聋的新理论。

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图1. 携带m.5783C>T突变的母系遗传性耳聋家系

本研究对中国汉族2651个耳聋病人以及574个正常对照进行线粒体基因组测序分析，鉴定出了m.5783C>T突变，该突变位于线粒体tRNA^Cys基因与线粒体轻链复制起始位点的重叠序列区域，紧临轻链复制起始位点的5’端，造成线粒体tRNA^CysTΨC臂50位高度保守的胞嘧啶核苷酸（C）转换为尿嘧啶核苷酸（U）；而且线粒体tRNA^Cys基因的5’端与tRNA^Tys基因的3’端共用一个腺嘌呤核苷酸（A），因此推测m.5783C>T突变会对线粒体DNA复制及tRNA^Cys与tRNA^Tys代谢产生影响。本研究的先证者（23岁）患重度感音神经性耳聋，其家系呈现明显的母系遗传模式，13个母系成员中5人表现出不同程度的听力损伤，发病年龄20-46岁，无其他临床疾病表型及氨基糖苷类抗生素药物史，母系成员中m.5783C>T突变均为同质性突变。本研究利用先证者源转线粒体融合细胞对m.5783C>T突变的分子致病机制进行了系统性研究。

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图2. 线粒体DNA与m.5783C>T突变位点模式图

双向凝胶电泳是分析DNA复制中间体的经典方法，在定位酵母DNA 复制起点、确定酵母复制叉阻抑点以及揭示DNA 复制抑制剂机理方面发挥了重要作用。本研究利用双向凝胶电泳实验分析m.5783C>T突变对DNA复制的影响，结果显示突变细胞株的OriL段线粒体DNA复制中间产物Y型复制叉上升段水平较正常对照株显著下降，提示线粒体DNA复制受损，线粒体DNA复制体关键蛋白PolγA、Twinkle及SSBP1水平均出现下降。利用Anti-BrdU抗体检测BrdU标记的新合成线粒体DNA，发现突变细胞株线粒体DNA合成效率降低；通过Southern blot与qPCR方法评估线粒体DNA拷贝数，显示突变细胞株线粒体DNA拷贝数随培养时间延长而持续下降，直至达到引发线粒体功能缺陷的50%拷贝数阈值，DNA拷贝数的变化可能是由于m.5783C>T突变造成的DNA复制效率下降引起。这些结果表明m.5783C>T突变影响线粒体DNA的复制，尤其是轻链的复制。

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图3. m.5783C>T突变影响线粒体DNA复制

图4. m.5783C>T突变引起粒体tRNA结构与功能异常

体外实验表明突变的tRNA熔解温度增加，构象改变且半衰期缩短。线粒体tRNA前体酶切实验分析表明，m.5783C>T突变可降低 RNase P催化tRNA^Cys前体5’端的加工效率，从而影响tRNA^Tyr稳态水平。利用转线粒体融合细胞模型进一步研究发现，携带m.5783C>T突变的细胞线粒体tRNA^Cys的稳态和氨基酰化水平均降低。tRNA结构和功能异常导致蛋白质合成受阻，引起线粒体内蛋白稳态失衡，呼吸链复合体氧化磷酸化活性降低，进而引发氧耗速率下降，线粒体ATP合成减少，线粒体膜电位降低，活性氧产生增加，促使细胞凋亡的发生。内耳毛细胞代谢旺盛、能量需求较高，且对内环境改变比较敏感，突变导致的线粒体供能不足和ROS增加会造成内耳毛细胞损伤和凋亡，影响内耳功能，最终引发耳聋。本研究解析了线粒体m.5783C>T突变在母系遗传性耳聋发生中的致病机制，为耳聋的病理机制研究与精准诊疗提供新视角。

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图5. m.5783C>T突变导致线粒体蛋白合成受阻

该研究受到科技部重点研发计划和国家自然科学基金等支持。浙江大学医学院附属儿童医院助理研究员孟飞龙，浙江大学遗传学研究所讲师贾子冬为本文第一作者，浙江大学遗传学研究所管敏鑫教授为本文通讯作者。

通讯作者介绍

管敏鑫，浙江大学求是讲席教授，973首席科学家。1983年毕业于杭州大学生物系，1993年获澳大利亚国立大学博士学位；1993-1999年任加州理工学院博士后；1999-2011年在辛辛那提大学儿童医院任助理教授、副教授、教授；2011年全职回到浙江大学工作，曾任生命科学学院院长、医药学部副主任，现任遗传学研究所所长。

曾获5项美国国立卫生研究院RO1基金，主持973计划，科技部重点研发计划，国家自然科学基金重点项目等课题。长期从事遗传性线粒体疾病的基础研究和临床转化，已建立3000余家系的母系遗传性耳聋、2000余家系的遗传性视神经病变的队列，围绕这些线粒体功能障碍所致出生缺陷的致病机制和精准诊治，开拓创新，取得了一系列具有国际领先水平的原创性研究成果并形成重要的理论体系。破解氨基糖苷类抗生素“一针致聋”之谜，发现了3个调控线粒体12S rRNA基因突变耳聋表型表达的核修饰基因TRMU、MTO1、GTPBP3，创新性地提出了核修饰基因和线粒体基因相互作用导致耳聋的新理论；多维度诠释线粒体tRNA突变位点通过影响tRNA结构稳定性、转录前体剪切、核苷酸修饰、氨基酰化以及线粒体DNA复制导致耳聋的新机制；在耳聋患者源的遗传缺陷型组织中实现iPSC的遗传矫正，实现听力功能重塑；授权国家发明专利9件，多项成果得到转化和广泛应用。

管敏鑫教授累计在J Clin Invest、Am J Hum Genet、Nucleic Acids Res、Circ Res等期刊上发表论文249篇；连续8年（2014-2021年）入选“Elsevier生化、遗传和分子生物学”高被引学者。曾获2次国家科技进步二等奖、谈家桢生命科学创新奖等奖励；授权国家发明专利11件；主编《医学遗传学》等教材；曾担任美洲华人遗传学会主席（2007-2008）和亚洲线粒体医学及研究学会主席（2011-2014）。